qPCR موثوق: جودة العينة والضوابط والإرسال

يتتبّع qPCR كمية الحمض النووي المضاعَف لحظة بلحظة عبر إشارة فلورية تُقرأ في كل دورة. والمخرج الأساسي هو قيمة Cq (وتُكتب أيضاً Ct)، وهي رقم الدورة التي تتجاوز عندها الإشارة عتبة محددة. وكلما زاد عدد الجزيئات المستهدفة في البداية بلغت الإشارة العتبة أبكر فتنخفض قيمة Cq. وCq ليست عدد نسخ بحد ذاتها، لكنها تتيح المقارنة بين عينات قيست في الظروف نفسها.

وهناك طريقتان لتحويل هذه القيمة إلى نتيجة. ففي القياس الكمي النسبي تُقارَن كمية الهدف بين العينات بالاستناد إلى جين مرجعي وعينة معايِرة، وتُعرض النتيجة على هيئة تغيّر مضاعَف. أما في القياس الكمي المطلق فيُبنى منحنى معياري من تخفيفات متسلسلة لمعيار معلوم عدد النسخ، وتُقرأ قيمة Cq للعينة على ذلك المنحنى. والمنحنى المعياري مصدر لحساب كفاءة التفاعل أيضاً، ولذلك لا يكون أي من النهجين ذا معنى دون منحنى موثوق أو كفاءة مثبتة. وتحديد النهج المطلوب قبل التحليل يحدد مباشرة خطة العينات والضوابط.

إذا كان RNA متحللاً فلا يستطيع أي بروتوكول qPCR إصلاح ذلك. وتُعرض سلامة العينة عبر أنظمة الرحلان الكهربائي الشعري بدرجة رقمية مثل RIN أو RQN؛ وهي مؤشر على التحلل، لكن لا توجد عتبة صحيحة واحدة تناسب كل أنواع العينات. فالأمبليكونات القصيرة أكثر تحمّلاً لـ RNA المتحلل جزئياً من الطويلة. والمهم أن يُحدَّد مستوى القبول مسبقاً وأن تكون جميع العينات المراد مقارنتها متقاربة في السلامة. وإذا اختلفت درجة التحلل بين المجموعات فلن يمكن التمييز بين فرق بيولوجي حقيقي وفرق تقني.

أكثر مؤشرات النقاء شيوعاً هي نسبتا A260/280 وA260/230 المقاستان بمقياس الطيف الضوئي. فانخفاض A260/280 قد يدل على بقايا بروتين أو فينول، وانخفاض A260/230 على بقايا عضوية مثل أملاح الغوانيدين أو الفينول أو الكربوهيدرات. لكنها مجرد مؤشرات: فالرقم الهيدروجيني وتركيب المحلول المنظِّم يغيّران القيم، وتصبح النسب غير موثوقة عند التراكيز المنخفضة جداً، وقد يوجد مثبّط حتى عندما تبدو النسب جيدة. وللتركيز قيد مماثل؛ فمقياس الطيف الضوئي لا يميّز RNA من DNA أو النيوكليوتيدات الحرة أو نواتج التحلل، بينما الطرق الفلوروميترية المعتمدة على الصبغات (مثل اختبارات Qubit) نوعية للجزيء المستهدف وتعطي عادةً تركيزاً أدق للعينات المخففة أو غير النقية. والجمع بين القياسين في التقرير هو النهج الأكثر إفادة.

عند قياس أهداف RNA لا بد أن تسبق qPCR خطوة النسخ العكسي (RT). وهي تفاعل إنزيمي يحوّل RNA إلى cDNA، وله تباينه الخاص: إذ تتوقف مردوديته على العينة وعلى استراتيجية البادئات (سداسيات عشوائية أو oligo-dT أو بادئات نوعية للجين) وعلى جودة RNA. ولذلك ينبغي معالجة العينات المراد مقارنتها بالبروتوكول نفسه للنسخ العكسي، ويفضّل في الدفعة نفسها وبكمية RNA متقاربة. وتطلب MIQE الإبلاغ المفصّل عن ظروف RT لأن هذه الخطوة من أقل مصادر التباين ظهوراً وأكثرها تأثيراً في النتيجة النهائية.

أما الخطر الكبير الثاني فهو بقايا الحمض النووي الجينومي (gDNA) في العينة، إذ قد يضاعف الهدف ويرفع الإشارة بصورة زائفة. ونتعامل معه بثلاثة إجراءات. الأول معالجة DNase أثناء تحضير RNA. والثاني تصميم بادئات تغطي إنترون أو تقع على وصلة إكسون-إكسون متى أمكن، فلا يعطي gDNA ناتجاً أو يعطي ناتجاً بحجم مختلف. والثالث، وهو الأهم، تشغيل ضابط no-RT، أي تفاعل لا يحتوي على إنزيم النسخ العكسي. فإذا أظهر ضابط no-RT إشارة واضحة فهي صادرة من gDNA، ويجب تفسير إشارة RNA الحقيقية للعينة في ضوء ذلك. ومن الممارسات الجيدة إذن إرسال كمية من RNA تكفي لضابط no-RT لكل عينة.

لا غنى في أي دراسة qPCR عن بضعة ضوابط. فضابط غياب القالب (NTC) يحتوي ماءً بدل القالب ويكشف تلوث الكواشف أو البيئة وثنائيات البادئات. وضابط no-RT يرصد بقايا gDNA كما سبق. والضابط الموجب يثبت أن التفاعل والبادئات يعملان، ويتيح خصوصاً التمييز بين فشل الاختبار والنتيجة السالبة الحقيقية. وفي الدراسات الموزعة على أكثر من صفيحة يتيح المعايِر بين التشغيلات، وهو العينة نفسها توضع على كل صفيحة، تصحيح الفروق بين الصفائح.

وفي القياس الكمي النسبي يمثل الجين المرجعي نفسه افتراضاً. فلا يوجد جين تدبير منزلي عالمي واحد؛ إذ قد يتغير تعبيره بحسب النسيج والمعالجة وظروف التجربة. وتوصي MIQE بالتحقق من الجينات المرجعية لكل نظام تجريبي، ويُفضَّل استخدام أكثر من جين مرجعي. وفي المكررات مفهومان لا ينبغي الخلط بينهما. فالمكررات التقنية (عادةً ثلاثية) تقيس خطأ التحميل والجهاز، أما المكررات الحيوية فتمثل التباين الحقيقي بين الأفراد أو العينات المستقلة وهي أساس أي استدلال إحصائي. وثلاثة مكررات تقنية لا تغني عن ثلاثة مكررات حيوية.

يجب التحقق من كفاءة أي زوج بادئات أو مسبار قبل استخدامه. وتُحسب الكفاءة من ميل المنحنى المعياري المبني على تخفيفات متسلسلة من cDNA للعينة أو من معيار معلوم. ومدى القبول الشائع الاستخدام هو من 90 إلى 110 بالمئة؛ والكفاءة خارج هذا المدى قد تدل على سوء تصميم البادئات أو بنى ثانوية أو تثبيط. وحين لا تقترب الكفاءة من مئة بالمئة لا يصح افتراض التضاعف التام في كل دورة المعتمد في الحسابات المقارنة، وتنحرف النتائج انحرافاً منتظماً. وللصبغات المتداخلة مثل SYBR Green يلزم أيضاً تحليل منحنى الانصهار: فالذروة الواحدة الحادة تدل على الناتج المتوقع، أما تعدد الذروات أو ظهور ذروة عند درجة حرارة منخفضة فيدل على نواتج غير نوعية أو ثنائيات بادئات. ولا يوجد منحنى انصهار في كيمياء المسابر المحللة بالماء؛ فالنوعية فيها تأتي من تصميم المسبار.

قد تأتي المثبطات من أوساط مثل الدم أو النسيج النباتي أو التربة أو محلول تحلل الخلايا، أو من بقايا كواشف الاستخلاص، فتؤخر قيم Cq أو توقف التفاعل أحياناً تماماً. وللعينات المشتبه بها يُستخدم اختبار التخفيف: تُخفَّف العينة على عدة مراحل ويُتحقق من أن Cq تنزاح بالمقدار المتوقع. فإذا انزاحت أقل بكثير من المتوقع أو ظهرت أبكر في العينة المخففة فهناك تثبيط. وكبديل يمكن إضافة كمية معلومة من ضابط spike-in خارجي يُظهر مباشرة هل يحدث تثبيط. والانتباه لهذه المشكلات قبل بدء التشغيل يوفر الوقت والعينة معاً.

تتضرر عينات الأحماض النووية بطريقتين رئيسيتين: التلوث بالنيوكلياز ودورات التجميد والإذابة المتكررة. وRNA حساس بوجه خاص. احفظ العينة في أنابيب خالية من النيوكلياز وفي ماء خالٍ من النيوكلياز أو محلول منظِّم مناسب، وقسّمها إلى حصص صغيرة لتجنب التجميد والإذابة المتكررين، واعمل على الجليد وأرسلها دون كسر سلسلة التبريد. وسمّ الأنابيب بوضوح بملصق متين يحمل رمز العينة ونوعها وتاريخها؛ فتطابق الأسماء في قائمة الشحن مع الأنابيب تماماً يمنع الالتباس. ويُستحسن الاتفاق مع المختبر على طريقة الشحن (ثلج جاف أو عبوات هلامية أو عينة مثبَّتة) قبل التحليل.

وفي نموذج الطلب اذكر: الجين أو التسلسلات المستهدفة، وتفاصيل البادئات أو المسبار إن وُجدت؛ والكيمياء المفضلة (صبغة SYBR أو مسبار محلل بالماء)؛ ونوع العينة وطريقة الاستخلاص؛ وعدد العينات وكمية المادة المتاحة؛ وعدد المكررات التقنية والحيوية المطلوبة؛ والضوابط والجينات المرجعية المستخدمة؛ والمخرج المتوقع (قيم Cq الخام أو التعبير النسبي أو عدد النسخ المطلق). تقدم NAKTEM خدمة التحليل الجزيئي بتقنية qPCR، ويتفق فريقنا معكم على متطلبات العينة والضوابط وطريقة الشحن قبل التشغيل. وهذا الحوار المسبق هو في الغالب أهم خطوة لموثوقية النتيجة.