qPCR قابل اعتماد: کیفیت نمونه، کنترل‌ها و ارسال

PCR کمّی مقدار DNA تکثیرشده را به‌صورت بی‌درنگ از طریق سیگنال فلورسانس ثبت‌شده در هر چرخه دنبال می‌کند. خروجی اصلی مقدار Cq (که Ct هم نوشته می‌شود) است: شمارهٔ چرخه‌ای که در آن سیگنال از آستانه‌ای تعریف‌شده عبور می‌کند. هرچه تعداد مولکول‌های هدف در ابتدا بیشتر باشد، عبور از آستانه زودتر رخ می‌دهد و Cq کوچک‌تر است. Cq به‌تنهایی تعداد نسخه نیست؛ بلکه مقایسهٔ نمونه‌هایی را ممکن می‌کند که در شرایط یکسان سنجیده شده‌اند.

برای تبدیل این مقدار به نتیجه دو راه وجود دارد. در کمّی‌سازی نسبی، مقدار هدف میان نمونه‌ها با یک ژن مرجع و یک نمونهٔ کالیبراتور مقایسه می‌شود و نتیجه به‌صورت تغییر چندبرابری گزارش می‌شود. در کمّی‌سازی مطلق، از رقت‌های متوالی یک استاندارد با تعداد نسخهٔ معلوم منحنی استاندارد ساخته می‌شود و Cq نمونه روی همان منحنی خوانده می‌شود. منحنی استاندارد منبع محاسبهٔ بازده واکنش نیز هست؛ بنابراین هیچ‌یک از دو رویکرد بدون منحنی قابل اتکا یا بازدهِ اعتبارسنجی‌شده معنا ندارد. روشن‌کردن رویکرد موردنیاز پیش از آنالیز، مستقیماً طرح نمونه و کنترل‌ها را شکل می‌دهد.

اگر RNA تخریب شده باشد، هیچ پروتکل qPCR نمی‌تواند آن را جبران کند. یکپارچگی با سامانه‌های مبتنی بر الکتروفورز مویینه به‌صورت یک نمرهٔ عددی مانند RIN یا RQN گزارش می‌شود؛ این نمره شاخصی از تخریب است، اما برای همهٔ انواع نمونه یک آستانهٔ «درست» واحد وجود ندارد. آمپلیکون‌های کوتاه نسبت به RNA نیمه‌تخریب‌شده تحمل بیشتری دارند و آمپلیکون‌های بلند چنین نیستند. نکتهٔ مهم این است که سطح پذیرش از پیش تعیین شود و همهٔ نمونه‌هایی که قرار است مقایسه شوند یکپارچگی مشابهی داشته باشند. اگر میزان تخریب میان گروه‌ها متفاوت باشد، تفاوت زیستی واقعی از تفاوت فنی قابل تفکیک نخواهد بود.

رایج‌ترین نشانه‌های خلوص، نسبت‌های اسپکتروفتومتری A260/280 و A260/230 هستند. A260/280 پایین می‌تواند به باقی‌ماندهٔ پروتئین یا فنل اشاره کند و A260/230 پایین به بقایای آلی مانند نمک‌های گوانیدین، فنل یا کربوهیدرات. با این حال این نسبت‌ها فقط سرنخ‌اند: pH و ترکیب بافر مقدار آن‌ها را تغییر می‌دهد، در غلظت‌های بسیار پایین نسبت‌ها قابل اعتماد نیستند و حتی با نسبت‌های مناسب نیز ممکن است بازدارنده وجود داشته باشد. دربارهٔ غلظت نیز محدودیتی مشابه وجود دارد. اسپکتروفتومتر نمی‌تواند RNA را از DNA، نوکلئوتیدهای آزاد یا فرآورده‌های تخریب تشخیص دهد، درحالی‌که روش‌های فلوریمتریک مبتنی بر رنگ (سنجش‌هایی از نوع Qubit) برای مولکول هدف اختصاصی‌اند و معمولاً برای نمونه‌های رقیق یا ناخالص غلظت دقیق‌تری می‌دهند. گزارش همزمان هر دو اندازه‌گیری آموزنده‌ترین رویکرد است.

هنگام اندازه‌گیری هدف‌های RNA، پیش از qPCR باید مرحلهٔ رونویسی معکوس (RT) انجام شود. این مرحله واکنشی آنزیمی است که RNA را به cDNA تبدیل می‌کند و تغییرپذیری خاص خود را دارد: بازده آن به نمونه، راهبرد آغازگرها (هگزامر تصادفی، oligo-dT یا آغازگر اختصاصی ژن) و کیفیت RNA بستگی دارد. به همین دلیل نمونه‌هایی که قرار است مقایسه شوند باید با یک پروتکل RT، ترجیحاً در یک نوبت و با مقدار ورودی RNA مشابه پردازش شوند. MIQE گزارش دقیق شرایط RT را می‌خواهد، چون این مرحله یکی از کم‌دیدترین اما اثرگذارترین منابع تغییر در نتیجهٔ نهایی است.

خطر بزرگ دوم، DNA ژنومی (gDNA) باقی‌مانده در نمونه است که می‌تواند هدف را تکثیر کند و سیگنال را به‌طور کاذب بالا ببرد. ما این خطر را با سه اقدام مدیریت می‌کنیم. نخست، تیمار با DNase در مرحلهٔ آماده‌سازی RNA. دوم، در صورت امکان، طراحی آغازگرهایی که اینترون را در بر بگیرند یا روی اتصال اگزون به اگزون بنشینند تا gDNA فرآورده‌ای ایجاد نکند یا فرآوردهٔ آن اندازهٔ متفاوتی داشته باشد. سوم و مهم‌تر از همه، اجرای کنترل no-RT، یعنی واکنشی که آنزیم رونویسی معکوس ندارد. اگر کنترل no-RT سیگنال آشکاری نشان دهد، آن سیگنال از gDNA است و سیگنال واقعی RNA نمونه باید با توجه به آن تفسیر شود. بنابراین ارسال RNA به مقداری که برای کنترل no-RT هر نمونه کافی باشد روش درستی است.

در هر مطالعهٔ qPCR چند کنترل ضروری است. کنترل بدون الگو (NTC) به‌جای الگو آب دارد و آلودگی معرف‌ها یا محیط و دایمرهای آغازگر را آشکار می‌کند. کنترل no-RT همان‌طور که گفته شد آلودگی gDNA را شناسایی می‌کند. کنترل مثبت نشان می‌دهد که واکنش و آغازگرها کار می‌کنند و به‌ویژه وقتی نتیجه منفی است، امکان تمایز میان شکست سنجش و منفی واقعی را می‌دهد. در مطالعاتی که روی بیش از یک پلیت اجرا می‌شوند، کالیبراتور میان‌اجرایی، یعنی نمونه‌ای یکسان که روی هر پلیت قرار می‌گیرد، امکان اصلاح تفاوت‌های میان پلیت‌ها را فراهم می‌کند.

در کمّی‌سازی نسبی، خود ژن مرجع یک فرض است. ژن خانه‌دار جهانی واحدی وجود ندارد؛ بیان آن بسته به بافت، تیمار و شرایط آزمایش می‌تواند تغییر کند. MIQE توصیه می‌کند ژن‌های مرجع برای هر سامانهٔ آزمایشی اعتبارسنجی شوند و ترجیحاً بیش از یک ژن مرجع به کار رود. دربارهٔ تکرارها نیز دو مفهوم را نباید با هم اشتباه گرفت. تکرارهای فنی (معمولاً سه‌تایی) خطای پیپت‌کردن و دستگاه را می‌سنجند، درحالی‌که تکرارهای زیستی تغییرپذیری واقعی میان افراد یا نمونه‌های مستقل را نشان می‌دهند و مبنای هر استنباط آماری‌اند. سه تکرار فنی جای سه تکرار زیستی را نمی‌گیرد.

هر جفت آغازگر یا پروب پیش از استفاده باید از نظر بازده اعتبارسنجی شود. بازده از شیب منحنی استانداردی محاسبه می‌شود که از رقت متوالی cDNA نمونه یا یک استاندارد معلوم ساخته شده است. محدودهٔ پذیرش رایج ۹۰ تا ۱۱۰ درصد است؛ بازده خارج از این محدوده می‌تواند نشانهٔ طراحی نامناسب آغازگرها، ساختارهای ثانویه یا مهار واکنش باشد. وقتی بازده به صددرصد نزدیک نباشد، فرض دوبرابرشدن کامل در هر چرخه که در محاسبات مقایسه‌ای به کار می‌رود معتبر نیست و نتایج به‌طور نظام‌مند جابه‌جا می‌شوند. برای رنگ‌های میان‌افزا مانند SYBR Green تحلیل منحنی ذوب نیز لازم است: یک قلهٔ تیز نشان‌دهندهٔ فرآوردهٔ مورد انتظار است، درحالی‌که چند قله یا قله‌ای در دمای پایین فرآورده‌های غیراختصاصی یا دایمر آغازگر را نشان می‌دهد. در شیمی‌های پروب هیدرولیزی منحنی ذوب وجود ندارد و اختصاصیت از طراحی پروب می‌آید.

بازدارنده‌ها می‌توانند از بسترهایی مانند خون، بافت گیاهی، خاک یا لیزات سلولی، یا از بقایای واکنشگرهای استخراج بیایند و مقادیر Cq را به تأخیر بیندازند یا گاهی واکنش را کاملاً متوقف کنند. برای نمونه‌های مشکوک آزمون رقت به کار می‌رود: نمونه در چند مرحله رقیق می‌شود و بررسی می‌شود که Cq به‌اندازهٔ مورد انتظار جابه‌جا شود. اگر Cq بسیار کمتر از انتظار جابه‌جا شود یا در نمونهٔ رقیق‌شده زودتر ظاهر شود، مهار وجود دارد. به‌عنوان راه جایگزین می‌توان مقدار معلومی از یک کنترل spike-in خارجی افزود که مستقیماً نشان می‌دهد مهار رخ می‌دهد یا نه. شناسایی چنین مشکل‌هایی پیش از اجرا هم در زمان و هم در نمونه صرفه‌جویی می‌کند.

نمونه‌های اسید نوکلئیک عمدتاً از دو راه آسیب می‌بینند: آلودگی با نوکلئاز و چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب. RNA به‌ویژه حساس است. نمونه را در لوله‌های فاقد نوکلئاز و در آب فاقد نوکلئاز یا بافر مناسب نگه دارید، آن را در آلیکوت‌های کوچک تقسیم کنید تا از انجماد و ذوب مکرر پرهیز شود، روی یخ کار کنید و بدون گسستن زنجیرهٔ سرما ارسال کنید. لوله‌ها را با برچسب مقاوم و با ذکر شناسهٔ نمونه، نوع و تاریخ به‌روشنی علامت‌گذاری کنید؛ یکسان‌بودن نام‌های فهرست ارسال با نام روی لوله‌ها از اشتباه جلوگیری می‌کند. بهتر است روش ارسال (یخ خشک، پک ژلی، نمونهٔ پایدارشده) پیش از آنالیز با آزمایشگاه هماهنگ شود.

در فرم درخواست این موارد را ذکر کنید: ژن یا توالی‌های هدف و در صورت وجود مشخصات آغازگرها یا پروبی که می‌خواهید به کار رود؛ شیمی ترجیحی (رنگ SYBR یا پروب هیدرولیزی)؛ نوع نمونه و روش استخراج؛ تعداد نمونه‌ها و میزان مادهٔ موجود؛ تعداد تکرارهای فنی و زیستی موردنظر؛ کنترل‌ها و ژن‌های مرجعی که باید استفاده شوند؛ و خروجی مورد انتظار (مقادیر خام Cq، بیان نسبی، تعداد نسخهٔ مطلق). NAKTEM خدمات آنالیز مولکولی qPCR ارائه می‌دهد و تیم ما پیش از اجرا الزامات نمونه، کنترل‌ها و روش ارسال را با شما هماهنگ می‌کند. همین گفت‌وگوی پیشین اغلب باارزش‌ترین گام برای قابل‌اعتمادبودن نتیجه است.