Güvenilir qPCR: numune kalitesi, kontroller, gönderim

Kantitatif PCR, her döngüde çoğalan DNA miktarını floresan sinyaliyle gerçek zamanlı izler. Cihazın ürettiği temel değer Cq (diğer adıyla Ct) değeridir: sinyalin belirlenen eşiği aştığı döngü numarası. Başlangıçta hedef molekül ne kadar çoksa eşik o kadar erken aşılır, yani Cq küçülür. Cq tek başına bir kopya sayısı değildir; ancak aynı koşullarda ölçülen numuneler arasında karşılaştırma yapmayı sağlar.

Bu değeri sonuca çevirmenin iki yolu vardır. Göreceli kantitasyonda hedefin miktarı, numuneler arasında bir referans geni ve bir kalibratör numuneye göre karşılaştırılır; sonuç kat değişimi olarak verilir. Mutlak kantitasyonda ise bilinen kopya sayısına sahip seri seyreltilmiş standartlardan standart eğri çizilir ve numunenin Cq değeri bu eğriye yerleştirilir. Standart eğri aynı zamanda reaksiyon veriminin de kaynağıdır, bu yüzden iki yaklaşım da güvenilir bir eğri ya da doğrulanmış verim olmadan anlamlı değildir. Hangi yaklaşımın gerektiğini analizden önce netleştirmek, numune ve kontrol planını doğrudan belirler.

RNA bozunmuşsa hiçbir qPCR protokolü bunu düzeltemez. Bütünlük, kapiller elektroforez tabanlı sistemlerle RIN veya RQN gibi bir sayısal değerle raporlanır; bu değer bozunmanın bir göstergesidir, ancak her numune türü için tek bir ‘doğru’ eşik yoktur. Kısa amplikonlar kısmen bozunmuş RNA’ya daha toleranslıdır, uzun amplikonlar değildir. Önemli olan, eşiği önceden belirlemek ve karşılaştırılacak tüm numunelerin benzer bütünlükte olmasını sağlamaktır. Bozunma düzeyi gruplar arasında farklıysa, gerçek biyolojik fark ile teknik fark birbirine karışır.

Saflık için en sık kullanılan ipuçları spektrofotometrik A260/280 ve A260/230 oranlarıdır. Düşük A260/280 protein ya da fenol kalıntısına, düşük A260/230 ise guanidin tuzları, fenol veya karbonhidrat gibi organik kalıntılara işaret edebilir. Ancak bu oranlar yalnızca ipucudur: pH ve tampon bileşimi değeri etkiler, nükleik asit konsantrasyonu çok düşükse oranlar güvenilmez hale gelir ve oran iyi görünse de bir inhibitör bulunabilir. Konsantrasyon için de benzer bir sınır vardır. Spektrofotometre, RNA, DNA, serbest nükleotid ve bozunma ürünlerini ayırt edemez; floresan boyaya dayalı yöntemler (Qubit benzeri) hedef moleküle özgü olduğu için düşük konsantrasyonlu ya da kirli numunelerde genellikle daha doğru bir konsantrasyon verir. İki yöntemi birlikte raporlamak en bilgilendirici yaklaşımdır.

RNA hedeflerini ölçerken qPCR’dan önce bir ters transkripsiyon (RT) basamağı gerekir. Bu adım, RNA’yı cDNA’ya çeviren enzimatik bir reaksiyondur ve kendi değişkenliğini taşır: verimi numuneye, primer stratejisine (rastgele heksamer, oligo-dT veya gene özgü primer) ve RNA kalitesine bağlı olarak değişebilir. Bu yüzden karşılaştırılacak numunelerin aynı RT protokolüyle, mümkünse aynı seride ve benzer RNA girdisiyle işlenmesi önerilir. MIQE, RT koşullarının ayrıntılı raporlanmasını ister, çünkü bu basamak sonucun en az görünür ama en etkili kaynaklarından biridir.

İkinci büyük risk, numunede kalan genomik DNA’nın (gDNA) hedefi çoğaltıp sinyali yapay biçimde yükseltmesidir. Bunu üç önlemle yönetiriz. Birincisi, RNA hazırlığında DNaz muamelesi uygulamaktır. İkincisi, mümkün olduğunda intron’u kapsayan ya da ekson-ekson birleşim yerine oturan primerler tasarlamaktır; böylece gDNA’dan ürün oluşmaz ya da farklı uzunlukta olur. Üçüncüsü ve en önemlisi, ters transkriptaz içermeyen bir no-RT kontrolü çalıştırmaktır. No-RT kontrolünde belirgin bir sinyal varsa, bu sinyalin gDNA’dan geldiği anlaşılır ve numunenin gerçek RNA sinyali buna göre yorumlanmalıdır. Bu nedenle, her RNA numunesi için no-RT kontrolüne yetecek miktarda RNA göndermek iyi bir pratiktir.

Her qPCR çalışmasında birkaç kontrol vazgeçilmezdir. Şablonsuz kontrol (NTC), şablon yerine su içerir ve reaktif ya da ortam kontaminasyonunu, primer dimerlerini gösterir. No-RT kontrolü yukarıda anlatıldığı gibi gDNA bulaşını yakalar. Pozitif kontrol, reaksiyonun ve primerlerin çalıştığını kanıtlar; özellikle sonucun ‘negatif’ çıktığı durumda test başarısızlığıyla gerçek negatifi ayırt etmeyi sağlar. Birden fazla plakaya yayılan çalışmalarda ise her plakaya aynı numuneyi koyan bir plakalar arası kalibratör, plakalar arası farkın düzeltilmesine izin verir.

Göreceli kantitasyonda referans genin kendisi bir varsayımdır. Tek bir ‘evrensel’ ev-temizlik geni yoktur; ifadesi doku, tedavi ve deney koşuluna göre değişebilir. MIQE, referans genlerin her deney sistemi için doğrulanmasını ve tercihen birden fazla referans gen kullanılmasını önerir. Replikatlarda da iki ayrı kavramı birbirine karıştırmamak gerekir. Teknik replikatlar (genellikle üçlü) pipetleme ve cihaz hatasını ölçer; biyolojik replikatlar ise bireyler ya da bağımsız örnekler arasındaki gerçek değişkenliği temsil eder ve istatistiksel çıkarımın dayanağıdır. Üç teknik replikat, üç biyolojik replikatın yerini tutmaz.

Bir primer çifti ya da prob, kullanılmadan önce verimi açısından doğrulanmalıdır. Verim, numune cDNA’sının veya bilinen standardın seri seyreltmesinden elde edilen standart eğrinin eğiminden hesaplanır. Yaygın olarak kullanılan kabul aralığı yüzde 90 ile 110’dur; aralık dışı verim, kötü tasarlanmış primerlere, ikincil yapılara ya da inhibisyona işaret edebilir. Verim yüzde yüze yakın değilse, karşılaştırmalı hesaplarda ‘her döngüde tam iki katlanma’ varsayımı geçersiz olur ve sonuçlar sistematik olarak sapar. SYBR Green gibi interkalasyon yapan boyalarda ayrıca erime eğrisi analizi gerekir: tek bir keskin pik beklenen ürünü, birden fazla pik ya da düşük sıcaklıkta pik non-spesifik ürünü veya primer dimerini gösterir. Hidroliz probu kimyalarında erime eğrisi yoktur; spesifiklik prob tasarımıyla sağlanır.

İnhibitörler kan, bitki dokusu, toprak, hücre lizatı gibi matrislerden ya da ekstraksiyon kalıntılarından gelebilir ve Cq değerlerini geciktirir, bazen reaksiyonu tamamen durdurur. Şüphe edilen numunelerde seyreltme testi uygulanır: numune birkaç kademe seyreltilir ve Cq’nun beklenen miktarda kaydığı gözlenir. Seyreltme sonucu Cq beklenenden çok daha az kayıyorsa ya da seyreltilen numunede Cq erkene gidiyorsa, inhibisyon vardır. Alternatif olarak bilinen miktarda bir dış spike-in kontrolü eklenerek, inhibisyon olup olmadığı doğrudan görülebilir. Bu tür sorunlar çalıştırma başlamadan önce fark edilirse zaman ve numune kaybı önlenir.

Nükleik asit numuneleri en çok iki yolla zarar görür: nükleaz bulaşması ve tekrarlanan donma-çözünme döngüleri. RNA özellikle hassastır. Numuneyi nükleazsız tüplerde ve nükleazsız suda ya da uygun tamponda saklayın, küçük alikotlara bölerek tekrar donma-çözünmeyi önleyin, buz üzerinde çalışın ve soğuk zinciri bozmadan gönderin. Tüpleri dayanıklı bir etiketle, numune kimliği, tür ve tarih bilgisiyle açıkça işaretleyin; gönderim listesindeki adlarla tüp üzerindeki adların birebir aynı olması karışıklığı önler. Gönderim yöntemini (kuru buz, jel paketi, stabilize edilmiş numune) analizden önce laboratuvarla birlikte belirlemek en doğrusudur.

Talep formunda şunları belirtin: ölçülecek hedef gen ya da diziler ve varsa kullanmak istediğiniz primer ya da probun bilgileri; tercih edilen kimya (SYBR boyası ya da hidroliz probu); numune türü ve ekstraksiyon yöntemi; numune sayısı ve ne kadar materyal bulunduğu; istenen teknik ve biyolojik replikat sayısı; kullanılacak kontroller ve referans genler; ve beklenen çıktı (ham Cq değerleri, göreceli ifade, mutlak kopya sayısı). NAKTEM, qPCR moleküler analiz hizmeti sunar; ekibimiz numune gereksinimlerini, kontrolleri ve gönderim yöntemini çalıştırmadan önce sizinle birlikte netleştirir. Bu önceden yapılan görüşme, çoğu zaman sonucun güvenilirliğini belirleyen en değerli adımdır.